Marc Webb, gençlik hikâyelerini şehir efsaneleriyle buluşturan bir yönetmen olarak bu kez Peter Parker’ın ilk büyük sınavına odaklanıyor. Peter Parker lise sıralarında yaşayan, ailesini kaybettikten sonra amcası Ben ve halası May ile kalan bir gençtir. Bir gün babasına ait eski bir çantayı bulur ve bu onu Oscorp’ta çalışan Dr. Curt Connors’a götürür. Oscorp’ta geçirdiği bir deney sırasında bir örümcek Peter’ı ısırır, kısa süre sonra duvarlara tırmanan, hızlanan ve güçlenen bir Spider-Man ortaya çıkar. Gwen Stacy’ye hayat veren Emma Stone, Peter’ın hayatında önemli bir yer tutarken, Dr. Connors’a hayat veren Rhys Ifans laboratuvarda yürüttüğü çalışmaları bedeninde denemeye başlar. Bu deneyler onu korkunç bir yaratığa, Kertenkele’ye dönüştürür. Spider-Man sokaklarda suçluların peşine düşerken, Peter hem Gwen’i hem de New York’u bu tehdide karşı korumaya çalışır.